Obtenção e caracterização de queratinase de bacillus sp. P45 a partir de coprodutos e aplicação na produção de queijos cremosos enriquecidos com chia e quinoa

Abstract

As proteases constituem 60-65% do mercado global das enzimas industriais e são utilizadas na indústria de alimentos no processo de amaciamento de carne, na síntese de peptídeos, preparo de fórmulas infantis, panificação, cervejarias, produtos farmacêuticos, diagnósticos médicos, como aditivos na indústria de detergentes e na indústria têxtil no processo de depilação e transformação do couro. Proteases específicas produzidas por micro-organismos queratinolíticos são chamadas de queratinases e distinguem-se de outras proteases pela maior capacidade de degradação de substratos compactos e insolúveis como a queratina. Atualmente, processos que apontem o uso total das matérias-primas e que não resultem em impactos negativos ao meio ambiente tem ganhado destaque. Dentro desta temática, destacam-se a reutilização da farinha de penas residual durante o cultivo do Bacillus sp. P45 para produção de proteases e a biomassa residual de levedura, ambas com elevados teores de proteínas, podendo ser utilizadas no cultivo do Bacillus sp. P45 para obtenção de proteases. O objetivo deste trabalho foi obter a enzima queratinase purificada em grandes quantidades, sua caracterização, bem como a sua aplicação em processos de coagulação enzimática do leite para o desenvolvimento de um queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa. Além disso, aplicar diferentes coprodutos para produção de enzimas proteolíticas e queratinolíticas. A presente tese foi dividida em quatro artigos: no primeiro foi realizado a obtenção da queratinase purificada em maiores quantidades e a determinação dos parâmetros de estabilidade térmica e a influência de componentes químicos na atividade enzimática. A obtenção da enzima em maiores quantidades alcançou fatores de purificação de 2,6, 6,7 e 4,0 vezes, paras 1º SAB, 2º SAB e diafiltração, respectivamente. A recuperação enzimática alcançou valores de 75,3% para o 1º SAB, 75,1% no 2º sistema e 84,3% na diafiltração. A temperatura de 55ºC e o pH 7,5 foram determinados como ótimos para atividade da enzima queratinase. O valor da energia de desativação (Ed) médio foi de 118,0 kJ/mol e os valores de z e D variaram de 13,6 a 18,8ºC, e 6,9 a 237,3 min, respectivamente. Além disso a adição de sais (CaCl2, CaO, C8H5KO4 e MgSO4) elevou a atividade da enzima na presença destes compostos. O segundo artigo apresenta a aplicação da queratinase como coagulante de leite bovino e sua aplicação na obtenção de queijo cremoso enriquecido com chia e quinoa. A enzima mostrou atividade de coagulação semelhante ao coagulante comercial, na concentração de 30mg/mL. A enzima purificada foi empregada de forma eficiente na fabricação do queijo cremoso, que apresentou valores de pH de 5,3 e acidez de 0,06 a 0,1 mol/L, com elevação durante os 25 dias de armazenamento. O terceiro artigo apresenta o perfil do queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa, o qual apresentou alto índice de retenção de água (>99,0%) e baixos valores de sinérese (<0,72%). Elevados teores de fibras foi verificado (3,0 a 5,0%), sugerindo seu consumo como fonte de fibras. As análises microbiológicas foram de acordo com a legislação vigente. Na análise sensorial foi verificado altos valores de suavidade ao paladar e verificado maiores valores de consistência e untabilidade nas amostras com maiores concentrações de nata e quinoa. O quarto artigo traz a extração de β-galactosidase por ultrassom e o uso da biomassa residual da levedura, bem como o uso de farinha de penas residuais como substrato para obtenção de proteases. O ultrassom foi eficiente para ruptura celular e extração de β-galactosidase, apresentando alta atividade (35,0 U/mL) e rendimento (876,0 U/g de biomassa). A maior atividade proteolítica (1300 U/mL em 32 h) e queratinolítica (89,2 U/mL) verificadas ocorreram utilizando-se a biomassa e a farinha de penas residuais, respectivamente. Maior produtividade proteolítica (40,8 U/mL/h) foi verificado no meio utilizando biomassa residual como substrato. Já a maior produtividade queratinolítica (2,8 U/mL/h) foi alcançada utilizando farinha de penas reutilizada.

Proteases constitute 60-65% of the global market for industrial enzymes, and most of them are alkaline proteases used in the food industry in meat tenderizing process, in peptide synthesis, preparation of infant formula, baking and brewing. Furthermore, they are used in pharmaceutical industry, medical diagnostics, as additives in laundry detergents and textile industry in the process of waxing and processing of leather. The specific proteases produced by keratinolytic microorganisms are denominated keratinases and distinguished from the other proteases due to their higher capacity to degrade compact and insoluble substrate such as keratin. Currently, processes that converge to the total use of raw materials and do not result in negative impacts on the environment has great importance. Within this theme, we highlight the feather meal; solid residue generated from the Bacillus sp. cultivation P45 for the production of proteases and the biomass resulting of the bioprocess for obtaining β- galactosidase by the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7982, which is used for conversion of lactose into glucose and galactose. After the extraction step, the enzyme is intended for its application and the residual biomass with a high protein content should be used in cultivation of Bacillus sp. P45 to keratinase obtainment. The objective of this work was the production of enzyme keratinase from byproducts, purification and characterization, as well as its application in enzymatic milk clotting processes for the development of dairy products. This thesis was divided into four articles: on the first one, the keratinase purification was performed using systems of larger capacity and in addition, the enzyme was characterized in terms of optimum pH and temperature, kinetic parameters of denaturation and the influence of salts and organic solvents over the enzymatic activity. The use of systems with larger purification capacities allowed the obtainment of the purified enzyme in larger quantities without compromising purity and recovery. The optimum temperature and pH for enzyme activity observed was 55º C and 7.5, respectively. The enzyme showed a reduction of half-life (t1/2) with increased along with the incubation temperature and constant thermal denaturation was inversely proportional to t1/2. Furthermore, the salts CaCl2, CaO, and C8H5KO4 and MgSO4 led to higher enzyme activity. The second article presents the keratinase as an alternative coagulant bovine milk and its application in developing a cream cheese enriched with chia and quinoa. The clotting enzyme showed similar activity to the commercial coagulant at a concentration of 30 mg/mL, being capable of hydrolysing casein present in the milk. The new coagulant was used efficiently in the development of dairy product enriched with chia and quinoa, functional components. The third article presents the evaluation of technological, physical, chemical and microbiological characteristics of the cream cheese enriched with chia and quinoa, which presented high water retention rate and low syneresis values. The high fiber content suggests that the product can be consumed as a source of fibers with health benefits. Microbiological and technological analysis showed that the cheese is stable and innovative, meeting the market's expectations for this type of product. The fourth article brings the extraction of β-galactosidase by ultrasound and the use of yeast biomass waste, as well as the use of flour waste feathers as a substrate for obtaining proteases. The ultrasound was efficient for cell disruption and extraction β-galactosidase, with high activity (35.0 U/ml) and yield (876.0 U/g of biomass). The major proteolytic activity (1300 U/ml for 32 h) and keratinase (89.2 U/ml) were verified using flour biomass and waste feathers, respectively.